Durante la etapa colonial, la comunidad cruceña definió su futuro, en medio de las necesidades, por la larga distancia que había de los centros de poder y riqueza -como Sucre y Potosí- y el constante conflicto por los ataques de indígenas chiriguanos, principalmente y, luego, por los bandeirantes de Brasil.
El español Ñuflo de Chaves gestionó, ante Lima, en 1560, la creación de la Gobernación de Moxos, que incluía una gobernación independiente a la de Asunción, “con el objetivo de descubrir y conquistar tierras desconocidas al norte de la Gobernación de Asunción”, de acuerdo con el relato del libro ‘La permanente construcción de lo cruceño’, de la historiadora cruceña Paula Peña.
La fundación de Santa Cruz se dio con el objetivo de organizar incursiones de búsqueda en la selva para encontrar el mítico Dorado o Paitití, que era el mito de un reino de oro.
Santa Cruz de la Sierra fue fundada el 26 de febrero de 1561 en el sitio que hoy conocemos como Santa Cruz La Vieja, en San José de Chiquitos y, posteriormente, tuvo dos traslaciones por falta de condiciones para vivir como agua y los constantes ataques de los indígenas.
La primera traslación ocurrió entre 1601 y 1604 cerca de Cotoca, posteriormente, se dio una segunda traslación en 1621 a su actual ubicación al margen derecho del río Piraí, donde se anexó con la ciudad de San Lorenzo.
La Iglesia Católica fue una parte importante en los primeros años de la ciudad, porque llegó a establecerse el Obispado de Santa Cruz, con la finalidad de evangelizar a los indígenas y mestizos, debido a que la gente desconocía la fe católica.
La nueva población oriental fue considerada como una frontera política y militar por Charcas, ante las incursiones de los bandeirantes desde Brasil en busca de esclavos y de los indígenas.
Santa Cruz solo albergaba una población indígena mayoritariamente, pero con la llegada de los pocos españoles se dio el proceso de mestizaje.
La economía cruceña era de autosustento y la producción agrícola que difícilmente podía ser vendida en otras regiones, por la larga distancia que había con ciudades como Sucre y Potosí, donde se explotaban los minerales y de países, como Brasil y de Argentina, por los riesgos de ataques indígenas y la falta de caminos.
El potencial exportador de Santa Cruz de la Sierra comenzó con el algodón y posteriormente con el azúcar, que era llevado hasta Potosí.